Es un proceso mediante el cual el almidón presente en la harina se transforma en glucosa. El encargado de realizar la fermentación es la levadura, en este caso, la masa madre. La levadura se alimenta de los azúcares y se producen dos fenómenos: por un lado generan dióxido de carbono y etanol qué es lo que ayuda al levado del pan y por otro lado se producen un gran número de moléculas responsables de los ácidos acético y láctico que son los responsables de que el pan sepa a pan. 

De una manera más sencilla la fermentación es la responsable de que la masa crema y que permitirá la obtención de un pan alveolado, esponjoso y ligero y por otro es la responsable de que el pan adquiera los auténticos sabores del pan. La fermentación empieza en el amasado y finaliza en el momento que la cocción alcanza los 55ºC (hace referencia a la temperatura de la masa) que es cuando mueren todos los microorganismos (levadura)

El proceso de fermentación del pan puede dividirse en dos fases:

• La primera fase de la fermentación, conocida como “primer levado”, tiene lugar entre el final del mezclado y el formado de las piezas. Esto es lo que determina el sabor del pan, la textura alveolar y el crujiente de la corteza. Dependiendo de si se usa levaduras comerciales o naturales es recomendable ralentizar esta fermentación en frío, metiendo por ejemplo la masa en el frigorífico. 
• La segunda fermentación, conocida como “fermentación final”, tiene lugar después del formado y antes de la cocción. Ésta es responsable principalmente del levado de la masa.